Nature | 纳米级荧光成像揭秘细胞膜上PIEZO1的伸展构象

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感知和转换来自环境的机械信息的能力对于生命体中各种生理过程至关重要¹。机械转导通道利用机械功直接打开离子通道，以响应细胞膜的扰动，从而启动细胞信号传导。PIEZO 是真核生物中机械转导通道家族²，介导哺乳动物的大量生理过程，包括触觉、血压控制、血管发育、机械瘙痒和红细胞水合状态等等。PIEZO 是一种大型同源三聚体膜蛋白³。其中PIEZO1 的冷冻电子显微镜 (Cryo-EM) 结构缺少大约三分之一的远端叶片，这是由于远端叶片的柔性很高。而冷冻电镜结构模型会把一些信号平均掉，所以不能解析潜在的范围很宽的不同构象，尤其是来自于这些柔性相对很大的结构域。

2023年8月16日，来自美国霍华德·休斯医学研究所神经科学系的Ardem Patapoutian教授实验室在Nature上发表了题为Direct observation of the conformational states of PIEZO1的文章。他们通过纳米级荧光成像对于细胞膜上单个PIEZO1的构象变化进行了观察，发现了PIEZO1在原始细胞膜上由于膜应力处于一种更加伸展的状态。

首先，本文对于PIEZO1进行了单分子标记。蛋白质标签和亲和探针在超分辨率荧光显微镜中会引入误差，因为荧光染料和标记位置在物理上存在偏移。为了最小化空间误差，本研究使用遗传密码扩展 (genetic code expansion) 和点击化学 (click chemistry)方法，将PIEZO1的每个亚基都标记有一个单独的细胞外荧光染料。在异源表达小鼠PIEZO1的HEK293细胞中，使用正交氨酰-tRNA合成酶和tRNA对来识别密码子UAG，将与转-环辛烯（TCOK）共轭的赖氨酸插入到第103个氨基酸。尽管通过冷冻电子显微镜尚未解析出PIEZO1叶片的最后约三分之一结构，但AlphaFold II和使用PIEZO2结构的同源建模已经预测了该区域的结构。氨基酸103位于PIEZO1相对于孔道的最远端细胞外的一段loop上，这些位置在三维结构中相隔19.2纳米。本文对表达TCOK 103 PIEZO1的活细胞进行了标记，使用的点击底物是连着Alexa Fluor 647的四氮唑烷。已确认这个loop是细胞外的，并且也确定加标签或点击标记不会损害通道功能。标记后，细胞被固定在等渗交联溶液中，以防止细胞形态的变化，并且在不渗透化的情况下进行成像，以保持质膜的完整性。总体而言，本文的标记系统将荧光染料引入到PIEZO1的氨基酸链中，物理偏移误差小于1纳米，并在原生细胞环境中捕获了通道的图像。

本文发现PIEZO1的定位云大约延长了3倍（图1），研究者们猜想这是由于远端叶片的比较大的柔性导致的不同构象的叠加。于是研究者们分离出每个定位云去计算相邻叶片之间的距离。相比于AlphaFold II预测的结构，细胞中的PIEZO1伸展的距离增加了6.2 ± 5.9 nm（图1）。因为结构模型是无膜情况下的，所以这些数据也可能说明细胞膜施加了足够的应力导致了PIEZO1在静息状态下也是处于伸展的。

图1. PIEZO1的定位云大约延长了3倍

为了验证这两种猜想，研究者们使用了一种3D超分辨荧光显微镜MINFLUX，它的定位差异只有5～6  nm，而在本研究中采用的3D样品固定系统更是把误差缩小到了2 nm，更加减少了样品漂移和震动带来的影响。通过这种技术，研究者们看到了三标的颗粒，进一步通过3D高斯混合物模型确定了荧光的中心位置以及位置的不确定性（图2）。同样的，和iPALM中的结果类似，研究者们也发现了定位云的非球形的延伸（图2）。而且他们观察到PIEZO1叶片远端的区域在细胞膜上会相比于AlphaFold II 预测的结构平均延伸29%。此外，叶片间距离的标准差比实验定位误差要大，这说明了叶片的延伸是由于叶片内在的灵活性。

图2. 利用MINFLUX定位PIEZO1

接下来，研究者们想探究的是叶片的延伸是否直接被细胞膜调控。所以他们对比了无膜的孔道结构和AlphaFold II预测的结构。他们根据已经解析的冷冻电镜结构把PIEZO1纯化出来，也在103位氨基酸处进行标记，并且固定在PEG刷表面从而进行MINFLUX成像。他们发现在无膜情况下确实叶片间距减少了很多（图3）。

图3. 无膜状态下的PIEZO1叶片间距

所以这也就引出一种可能性，那就是抑制PIEZO1的功能可以通过类似于去掉细胞膜造成叶片压缩的机制来实现。GsMTx-4 是一种来自于智利玫瑰狼蛛的肽毒素，它广泛作用于机械力敏感的离子通道，但是它的作用机制尚不清楚。有研究表明，GsMTx-4结合脂双层的K_d值和它结合PIEZO1的IC₅₀都是大约2 mM，这和它会靶向脂双层的特征是一致的。此外，分子动力学模拟表明，GsMTx-4 根据脂双层张力在浅层和深层之间切换，充当膜材料的移动储备，实际上成为了一个减少局部膜应力的缓冲器。所以本文推测GsMTx-4会直接嵌入PIEZO1形成的细胞膜穹顶从而释放周围的张力以保持叶片的舒展。确实，在加了GsMTx-4之后，叶片间距显著减少了（图4）。

图4. GsMTx-4减少了PIEZO1叶片间距

所以以上这些实验表明叶片的延伸主要是被细胞膜调控而不是依附于细胞骨架或者胞外基质。此外，研究者们对于叶片柔性导致的构象变化程度进行了分析。因为构象状态覆盖了很大的范围，所以研究者们推测这可能是由于PIEZO1结构上的某些特征导致。PIEZO1的每一个叶片可以被分为9个重复的结构域，每一个都形成了由四个包含重复结构间结合界面的跨膜螺旋组成的簇（图5）。使用 PIEZO1 叶片的 AlphaFold II 结构，研究者们计算了PIEZO 重复域之间结合能 (−ΔG）。他们观察到沿叶片近端到远端，−ΔG 急剧、分级下降（图5），这与直接从冷冻电镜结构计算出的 PIEZO2 重复域结合能一致，这也能解释为什么冷冻电镜没有解析远端叶片。

图5. PIEZO1一个叶片的结构示意图和重复域−ΔG的变化

研究者们继续探究是否可以在单个标记的位点观测叶片灵活性造成的变化。他们通过改变质膜的脂质组成来改变膜硬度，例如十七烷酸会增加膜的硬度和粘度，从而减少随机热运动引起的叶片位移的幅度。他们用富集表达 PIEZO1 的十七烷酸质膜通过MINFLUX 成像，发现远端叶片的叶片间距离的变化显着减少，与叶片波动幅度的明显减少一致（图6）。

图6. 十七烷酸对于PIEZO1叶片间距的影响

相对于本研究中观察到的GsMTx-4 通过释放膜弯曲应力来抑制 PIEZO 通道活性，对细胞膜施加力则会激活 PIEZO1，这是通过横向膜张力和膜穹顶变形来调控的。因此，本文进一步关注当质膜拉伸时叶片延伸的程度。低渗的细胞外环境通过渗透性膨胀增加细胞体积， 而这种膨胀会对质膜施加张力。渗透膨胀也会诱导 Ca²⁺ 通过 PIEZO1 流入，但没有电生理证据表明它在正常条件下直接激活通道。机械诱发的 PIEZO1 电流在负膜电位下快速失活，而 HEK293 细胞的渗透膨胀速率很慢，在大约 2.5 分钟内达到峰值体积。因此，研究者们怀疑快速失活掩盖了响应渗透膨胀的PIEZO1通道激活。渗透膨胀还会通过普遍存在的容量调节阴离子通道 SWELL1引发向外的氯离子电流，进一步掩盖 PIEZO1 诱发的电流。所以本文通过测量 Swell1 敲除的 HEK293 细胞中渗透诱导的 PIEZO1 激活来规避这两个问题。研究者们观察到PIEZO1依赖的比较大的电流随着细胞肿胀的变化过程（图7），这表明渗透膨胀引起的膜拉伸可以直接激活PIEZO1。

图7. 低渗胞外溶液对于PIEZO1活性的影响

本文还测试了小分子激动剂 Yoda1，它与渗透压诱导的细胞肿胀一样，会导致 PIEZO1 依赖性的大量Ca²⁺ 地进入细胞。Yoda1 减慢了通道失活的速度，并在没有施加力的情况下显着增加了通道打开概率。Yoda1 激活 PIEZO1 的确切机制尚不清楚，但分子动力学模拟和突变实验表明它结合在 PIEZO1 重复序列 A 和 B之间的口袋中。为了比较通道激活与渗透膨胀的相对程度，研究者们测量了由水浴施加的 50 μM Yoda1 至 Swell1 敲除的 HEK293 细胞（保持在正膜电位）所诱发的全细胞电流（图8 ）。他们还在没有机械刺激的情况下观察到来自水浴灌注 Yoda1 的大电流（超1 nA），这表明这两种不同的刺激都强烈激活PIEZO1（图8）。

图8. Yoda1对于PIEZO1活性的影响

总的来说，本文利用纳米级荧光成像对于细胞膜上单个PIEZO1的构象变化进行了观察。相比于之前报道的PIEZO1结构模型，本文发现了在静息状态时，PIEZO1的叶片由于细胞膜应力处于极大地伸展状态。并且伸展的程度随着叶片的延伸变化很大。此外，本文还证明了一些化学以及机械的调节剂会对于PIEZO1叶片的延伸以及孔道的激活进行调节。本文揭示了PIEZO1在原始膜环境中是如何被激活的，更进一步来说，本文提供了一种基于纳米级成像的对于膜蛋白的结构分析方法。

参考文献

参考文献

1. Kefauver, J. M., Ward, A. B. & Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature 587, 567-576, doi:10.1038/s41586-020-2933-1 (2020).

2. Coste, B. et al. Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science 330, 55-60, doi:10.1126/science.1193270 (2010).

3. Guo, Y. R. & MacKinnon, R. Structure-based membrane dome mechanism for Piezo mechanosensitivity. Elife 6, doi:10.7554/eLife.33660 (2017).

供稿 | 田露

审稿 | 张颖

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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